RT-PCRにおける偽陰性の原因（Dr.にしださんのまとめ②）

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その１】日本中が『１億総PCR厨』と化したただ中にいると、「ひょっとすると、自分の頭の方がオカシイのかしらん？」と不安にかられる事もあるけれど、海外発の論文やニュースに目を転じた時、"RT-PCR" と記載された文章を見つけ、ホッと安堵する今日この頃・・。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その２】これだけ、上から下まで "PCR" を誤用しまくっている国、そして専門用語であるにもかかわらず、国民全員が訳もわからず "PCR" を連呼している国もまた、極めて珍しい。ホント、戦時中に見られたメディア扇動と、何ら変わりはしないよね。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その３】そんな世の中をぶった切るため、オジサンは今宵も頑張りまッス！(何を？)

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その４】偽陽性については先日解説したので、本日のテーマはRT-PCRにおける「偽陰性」でございます。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その５】偽陰性の勘所をアタクシの個人的見解でまとめると、このようになる。 pic.twitter.com/w805LxqOid

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その６】まず最初に検体用的中のウイルスRNA濃度が、「検出感度」に達していないということ。ここは、極めて重要なポイントであります。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その７】日本のメディアは、彼らが大好きな「右か左か」と同じ次元で、"PCR検査"に対して「陽性か陰性か」という判断を下しているけれど、ここが勘違いの始まりの基となっている。世の中、何でも『二値』で判定できるほど、単純ではないのであります。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その８】ウイルスに、陽性も陰性もなし。あるのは、連続性をもった『ウイルス濃度』なのであります。これを英語で『virus load』という。新コロ論文は、この言葉が理解できないと、決して読み解けないのでご注意あそばせ。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その９】当たり前のことではあるけれど、検体中にウジャウジャと「星の数」ほどの新コロがうごめいているものから、せいぜい「数十匹」がポツネンと存在するものまで、濃度は極めて大きい範囲に及ぶ。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その10】新コロの場合、具体的にはおよそ「10匹から10億匹」の範囲に及ぶ(濃度の分母は1mL)。つまり、ゼロの数は「１個から９個」まで変わる。ここで、昔習った懐かしの対数の出番となる。ウイルス濃度をlog10で表現すれば「１から９」となり、グラフ表現に都合が良い。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その11】ここで、具体的な viral load のグラフを見てみよう。3月のLancet Infect Disに掲載され、唾液検査導入のきっかけのひとつにもなった、有名な論文(PMID 32213337)。縦軸をご覧頂きたい。Mean viral load、単位は log10 copies/mL となっていることがわかる。 pic.twitter.com/NX1QfFIyXf

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その12】例えば、グラフの右端にある青丸は「１」の高さにあるので、その濃度は10の1乗、すなわち "10 コピー/mL" であることを意味する。左端の方の青丸は「６」位の高さにあるので10の6乗、すなわち "100万コピー/mL" となる。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その13】検査キットと増幅＆検出機械の精度にもよるが、検出感度はおおよそ "１〜２ log10 copies/mL" すなわち、"数十コピー/mL" が信頼できる限界となる。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その14】このように、RT-PCRは、わずか100nm前後のウイルスちゃんが、数十匹うろちょろしているだけで、検出できる巧の技なのであります👏。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その15】よく、日本の識者達が「PCRの感度は低い」とか宣っておりまするが、アホ抜かせ！とオジサンは言いたい💢。RT-PCR以上に感度が良いRNAウイルス検出方法があるなら、是非ともアタシに教えてほしい。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その16】加えて、RT-PCRが測定可能な濃度範囲は、1 log10 copies/mLから9 log10 copies/mLまで、その濃度差は実に「１億倍」にも及ぶのであります。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その17】この気が遠くなるほどの「検体中ウイルス濃度の広がり」を日本のメディアはモチノロン、下手すると専門家ですら理解できていない・・。そして「陽性か陰性」で物事を論じてしまう、浅はかさ😭。

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その18】皆さまにおかれましては、「陽性か陰性か」ではなく、「連続性を持ったウイルス濃度」として捉える目を持って頂けましたら幸いに存じまする。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その19】そして、スライドにも小さい字で書いておりますが、ウイルス濃度が検出感度に達していない原因には、採取された検体が不適切であることに加え、「医師や看護師による検体の取り違え」、「技師によるRNA抽出の失敗」なども含まれることをお忘れなく。

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【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その20】２番目。これも既に解説した事でありますが、新コロはRNAウイルスであり、大切なゲノムRNAはエンベロープに守られております。しかし、検体保管が不適切であると、さすがのエンベロープも破壊され、RNAはあっという間にリボヌクレアーゼで分解バラバラ・・。

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その21】技師さんがRNA抽出を開始する以前に、目的のRNAは昇天されてましたぁ〜ということが起こる。保管のポイントは、高性能なウイルス輸送培地の選択と保管温度。これは、地方行政の責任。保管予算をケチると、RNAが分解される危険性は一気に上がる。

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その22】３番目。これは、単純に検査に関わる者の習熟度の問題。DNAは比較的安定なので、DNA操作というのは短い研修コースでもある程、習熟することは可能。しかし、RNA操作はDNA操作とは全く次元が異なる操作であり、「出来る人間と出来ない人間」がいる。

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その23】RNAを「リボヌクレアーゼの混入でぶち壊す」ような人は、何度やってもある頻度で繰り返す。これは教育ではどうしようもないので、適性判断が必要となる。すなわち「適切な人材の選択」であります。果たして、今の日本で適正検査は実施されているのか、否か・・

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その24】冷たいようだが、臨床検査医学の世界では、「誰が間違いを起こしやすいか」を把握することは、とても重要。全国の衛生研究所で、「間違いのサーベイランス」は実施されているのでありましょうか？もちろん、この間違いの原因には「疲労」も大いに関与する。

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その25】最後は、ちとオタッキーであるけれど、意外と実験室では多い原因。試薬の入れ間違いと機器操作ミス。かって「偽陽性」が報じられたとき、衛生研究所の人が「操作をダブルチェックします」と語っていたが、そんなもの、クリーンベンチの上で出来ますかいな・・。

ドクターにしだ @WataruNishida

【RT-PCRにおける偽陰性の原因・その26】人的エラーに関しては、極力操作手順を単純化するか、全自動化するしかない。全自動核酸処理装置の導入は、予算の関係で地方には到底無理だろう。となると『操作手順を簡略化できる検査キット』の導入が、最も現実的な道となる。これについては、いつかまた。