ｍRNAワクチンにDNAが大量残存

molbio08 @molbio08

Plasmidgateについてですが、今朝、早朝の4時からKevinさん登場のRumbleライブが開催されました。セネフさんのプレゼンから始まり、最後はKevinさんのプレゼンで終わるというものでした。KevinさんはmRNA型生物製剤へのDNAの大量残存をどのような経緯で見つけたかを説明していました。リンクは次に。

molbio08 @molbio08

セネフさんのプレゼンはプリオンに関するものでした。これもスライドを使用して説明していて参考になりました。今回はこのRumble動画で聞いたことを中心に発信します。Kevinさんは誠実な研究者という印象でした。 rumble.com/v2dgaf6-scienc…

molbio08 @molbio08

KevinさんはmRNA型生物製剤へのDNAの大量残存をどのような経緯で見つけたかを説明していました。mRNA型生物製剤に、転写が途中で完了した短いRNAが含まれているかもしれないと考えてRNAを逆転写してDNAに変換して配列決定をしてみたら予想していなかったベクター配列が見つかったというのが出発点。

molbio08 @molbio08

その後、DNAの定量、塩基配列の決定などを行った結果、大量のDNAの夾雑を見つけたという流れです。環状のプラスミドDNAも残存していて大腸菌を形質転換できてコロニーができるくらいですから、スパイクタンパク質の全長とT7プロモーターが連結されたものが残存している可能性は否定できない。

molbio08 @molbio08

Kevinさんは発現ベクターの配列を既に公開しており、さらにKevinさんが検証用に設計したPCRプライマーの配列も公開ずみ。後に続く研究者は出てくるでしょう。今回、Kevinさんが調べたロットだけなのか、あるいは多くのロットに同様に発現ベクターが含まれているかはいずれ、明らかになるでしょう。

molbio08 @molbio08

私が当初からmRNAワクチンのリスクを説明し警告したにもかかわらず、残念ながら接種してしまった人間が、私の周辺にも少なからずいます。そのため、今回のDNAの夾雑は特定のロットに限られていると言う結論を私は期待しています。どのような結論になるか他の研究者の追加の情報を待ちたいと思います。

molbio08 @molbio08

T7プロモーターは哺乳類細胞では機能しないと思いがちですが、もう一つ論文を紹介しておきます。ここで紹介する論文では、T7プロモーターがヒト細胞で機能することを示しています。T7プロモーターがHeLa細胞で機能するというもの。HeLa細胞はヒト子宮がん由来の有名な細胞。 pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8406019/

molbio08 @molbio08

スパイク遺伝子がT7プロモーターと連結された形態でヒトゲノムに組み込まれたときにスパイク遺伝子が発現する可能性は考えておくべきでしょう。スパイクのｍRNAは環状プラスミドを制限酵素で一カ所切断して、それを使用してT7RNA合成酵素でｍRNAを大量に合成しています。

molbio08 @molbio08

通常であれば、この方法では、1分子のDNAから10倍～100倍のｍRNAを合成できるとされていますので、このように大量に夾雑していることは考えにくいのですが、ウリジンが修飾されたシュードウリジンであるためにRNA合成の効率がかなり低下している可能性も考えられますのでこの点も検証が必要です。

molbio08 @molbio08

ｔRNAにはシュードウリジンが含まれていますのでｔRNAを合成するRNA合成酵素はシュードウリジンを効率よく利用できるはずですが、mRNAにはシュードウリジンは通常含まれません。したがってｍRNAを合成するタイプのRNA合成酵素がシュードウリジンをウリジンと同様に利用できるかは不明です。

molbio08 @molbio08

混じっている発現ベクターが環状のものかあるいは切断されたものかをKevinさんは解析していますが、環状のものも切断されたものも両方含まれている。環状のものだけであれば、残存したとしてもゲノムに組み込まれる際にはランダムな場所で切断されてからゲノムに組み込まれることになります。

molbio08 @molbio08

この場合にはゲノムに組み込まれてもスパイクタンパク質を発現する可能性は低いでしょう。しかし、実際には、T7プロモーターの上流部で切断していますので、もしもゲノムに取り込まれるとするとT7プロモーターとスパイク遺伝子が連続した形でゲノムに組み込まれる可能性は高いと思います。

molbio08 @molbio08

発現ベクターの夾雑が招くリスクはもう一つあります。SV40プロモーターがこの発現ベクターには組み込まれていますので、この配列を含むDNA断片が発がん遺伝子の上流部に組み込まれると発がん遺伝子の発現が亢進します。このことは細胞のがん化のリスクを高めることは言うまでもありません。

molbio08 @molbio08

DNA型腫瘍ウイルスであるSV40の強力なプロモーターのゲノムへの組み込みのリスクはKevinさんも言及。このようにベクターDNAが混じっているようではエンドトキシンの混入も懸念されます。これも彼は動画でコメントしています。エンドトキシンは細菌由来の毒素でアナフィラキシーなどの原因になります。

molbio08 @molbio08

何度も書いているように発現ベクターがmRNA型生物製剤に大量に残存しているということを発表しているのは現時点ではKevinさん一人です。またKevinさんはロットを多数調べたわけでもありません。しかしながら、ファイザーとモデルナ両方で同様に観察されたということを私は大変重く見ています。

molbio08 @molbio08

Kevinさんは発現ベクターの配列データを既に公表済みであり、PCRのプライマーも発表していますので他の研究者にも追試は可能になりました。KevinさんはLNPを除去しないといろいろな反応が動かない可能性についてもコメントしていましたので、実験する人は注意が必要です。DNAを精製後解析すべきです。

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

根本から説明してみましょう。この枠珍には何が必要でしょう。ⅿRNA枠珍なのですから、mRNAが必要。でも、ただmRNAを入れても異物として認識されて除去されるだけなんで、シュードウリジン化したmRNAが必要。保護するのにLNPもいりますね。ここまではいいですかね。

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

では次です。じゃそのｍRNAはどうやって作るか？発現ベクターという難しい名称の物を使いますが、要は輪っかの形をしたDNA。この輪っかの形をしたDNAを人工的に作り、合成酵素を加えてシュードウリジン化されたmRNAを作る。難しいこと全部抜きで輪っかにしたⅮNAからⅿRNAを作ります。ここまで大丈夫？ pic.twitter.com/MC1YFhpPuq twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

mRNAは作れた。でも、それだけではダメ。ⅿRNAですら逆転写して人間に影響を与える可能性があるわけですから元のDNAは残せない。全部は取り除けないものの減らさないとダメ。国の基準だと約3000分の1。これも根拠なく引き上げたものですが、最低でもそのくらいまで減らす必要があると決めた。大丈夫？ twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

つまりこの枠珍は輪っかのDNAからmRNAを作って、輪っかの方を切断し処理する工程の枠珍なんだね。そうやって少ししかDNAが残らないようにしてる。それがこの図。最初の黒い部分だけれど、それが全く上手くいってないことが発見された。ではそのうまく行かない理由は、何か？ここまでは理解できたかな？ pic.twitter.com/id5DD59qby twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

でね、もしかして、これがわかっていない？と思ったのはこの工程でⅿRNAは処理されないんだよ。だってDNaseIって黒い部分で使っている酵素は強力だけど、DNAだけじゃなくｍRNAまで処理したらｍRNAもなくなっちゃう。元から枠珍じゃないという話はともかく、それじゃⅿRNA枠珍にならないよね。わかる？ twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

DNAを処理するための酵素とｍRNAを処理する酵素は違う。そんなわけでDNAだけを処理してmRNA枠珍にはできる。でも、実際はDNAが取り除けていない。それは、mRNAとDNAが強固に結合していた場合、どんな酵素で処理するか？を考えてみるとわかるはず。ここから本題なんですね。わかりますか？ pic.twitter.com/ZOrDPRG5YP twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

つまり、 ⅮNAだけ処理したい⇒できる。 ⅿRNAだけ処理したい⇒できる。 では、ⅮNAから作ったシュードウリジン化したｍRNAが強固に結合したDNAは？⇒当然できるけど、それはそのｍRNAを処理しないとできないよね。という話になるわけです。 pic.twitter.com/YaSFY7GTF7 twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

DNaseIはDNAに切れ目を入れる酵素なんですね。けれども、長いｍRNAがDNA部分に強固に巻きついていると考えてみるとどうでしょう。たとえば木に斧で切れ目を入れようとしても、その斧では切れないツタが巻きついている。すると切れない。DNaseIはⅿＲNAを処理するものではないのでそうなるんですね twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

鎧のたとえより、こちらの方が良いですね。だから一応切れ目は入っていることが多いはず。しかし、充分に切れないため、基準を大幅に上回って枠珍に大量のＤＮＡが残ってしまっているのも、大きめのものが残ってしまっているのも確実。とりあえず、今日はこの辺で。 pic.twitter.com/yaGjy5sGsW twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

さて、クソ簡単に解説するシリーズに戻します。熱変性のとこだけ見てください。DNAが2つに分かれていますね？ＰＣＲはまずこういう原理で行いますが、前回説明したようにⅿRNAというツタがDNAという木に巻きついてしまっていると、そもそも最初のこの分離ができないのがわかりますか？ここまで大丈夫？ pic.twitter.com/Md5uux2U94 twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

高温でDNAの鎖を離す。高温とは具体的に95℃。難しい知識はここまで不要。熱反応により2本の鎖を離してＰＣＲは始まるんですね。ただその時にですね、シュードウリジン化ｍRNAがDNAに強力に結合している場合は、さらに9℃上げる必要があるというのがケビン氏報告なんですね。つまりＰＣＲ自体できない pic.twitter.com/7gFlkHCc6T twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

正確には図のようにＧＣが増え、かつシュードウリジン化ｍRNAがⅮNAと協力に結合していた場合9℃、ということですが、そもそも両社共にこの枠珍はこのＧＣが増やされているんです。とりあえず難しいことは抜きに、PCRで枠珍内のDNAを調べるなら絡みついたmRNAの処理が必要。ここまではわかりますね？ pic.twitter.com/ZEg7ofSQXv twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

なので枠珍内でＧＣが増やされている理由はおそらく、枠珍内に残ったＤＮＡを検出しづらくするため。皆DNaseIでDNAは切断されていると思いこみ調べもしなかったし、調べたところで利権側なら発表しない。発現ベクターのDNA配列を読まれても困るし、枠珍を調べるのを禁止しているのも、うなづける内容。 twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

どのみち効果がないことは最初からわかっている話だし、焼き畑農業のように、数年間一時的に稼ぐ方法としてはＧＣを増やしてＤＮＡを検出できないようにしておけば十分だった。日本だけ今後も打つのはむしろ予想外だった可能性の方が高い。そういうことなんでしょうね。 pic.twitter.com/4BD9rPy4Hj twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

続クソ簡単に説明してみる教室。DNAとmRNAが強固に結合。その場合、ⅿRNAを除去しないとPCRできない。そこまでは良いですね。しかし、できることもあるんです。普通なら大腸菌に輪っか型のプラスミドでないＤＮＡを入れても入りにくいのに、それほど入りにくくならない。おっと急に難しいですね pic.twitter.com/zMo3eAuZmf twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

菌にもグラム陽性とか様々な違いがあるんですが、要は膜付近に空間がある野郎もいる。とかでいいです。大腸菌はその空間豚野郎で、その空間にエキソヌクレアーゼという酵素を持ってる。この酵素には特徴があって、端っこからDNAを切断します。端っこ？円だと端っこはないよね？これでわかれば凄い。 pic.twitter.com/kGz4gECjAc twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

発現ベクターは円。大腸菌だったら特に円がいい。なぜなら円だと端っこから切断と言っても、端っこはないから大腸菌の酵素で切れない。一方で枠珍内に残ったDNAたちはこの円状の物から切断されているので円ではなく線。線だと端っこがあるので枠珍に残ったDNAは大腸菌に導入しにくいはず。ところが！ pic.twitter.com/9vKMqYs62c twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

切断されて線状になっているとは言うものの、製薬の手順でやったDNaseI（これは端っこから切る酵素ではない）ですら切断できなかったDNA。 つまりmRNAが強固に結合したDNAたちなわけです。そうするとですね。端っこから切っても切断できない。なので大腸菌にも入るわけです。ここまでわかります？ pic.twitter.com/O46KIqtSm1 twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

指摘の通り本来は導入しにくい。プラスミドのような輪っかのDNAのように簡単に導入はできない。ただ導入できることもあるから切断して試したりはする。でも、追試ってあのときは一発試験だよね。なのに大腸菌の酵素にやられずに入ってしまったわけですよ。植え替えてサテライトではないのも確認できた pic.twitter.com/CnJYaR0ry3 twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大

自粛マスク蛋白マン @1A48wvlkQc6mVdR

植え継いでも生えてきているからサテライトではない。しかも、プラスミドでもないのに、なぜか大腸菌に簡単にカナマイシン耐性遺伝子を導入できた。そりゃそうだ。確かにプラスミドではないが、枠珍に残ったDNAはmRNAと強固に結合してる。大腸菌の酵素では切断できないから導入できる。そういう話。 pic.twitter.com/VLubIcnbRt twitter.com/1A48wvlkQc6mVd…

拡大